生体触媒カスケードにより大環状ペプチド Enlicitide の製造が可能になります

MSD の治験中の経口 PCSK9 阻害剤であるエンシチド デカン酸 (MK-0616) は、ヒトにおいて実質的な LDL-C 低下を実証した最初の経口大環状ペプチド PCSK9 阻害剤です。 Enlicitide は、単環式ペプチドの mRNA ディスプレイ スクリーニングから開発され、その後非ペプチド架橋によって安定化されて、3 つの融合大環状分子を含む構造が生成されました。この複合オクタペプチドには、12 個のアミド結合と中央の 6 個の炭素鎖リンカーによって結合された 6 個の非天然アミノ酸と 2 個のタンパク質形成性アミノ酸が含まれています。 従来の化学合成には、保護基操作（合成ステップのほぼ半分）、クロマトグラフィー精製、および高濃度ルテニウム触媒による閉環メタセシスステップという 43 のステップが必要であり、拡張性と持続可能性が制限されています。

化学酵素製造開発

MSD の科学者らは、エンシチド デカン酸 (1) を製造するための簡潔で収束した化学酵素プロセスを開発しました。これは、アミノ酸リガーゼによるモノマーの直接カップリングと、エステラーゼとイミン レダクターゼを使用した生体触媒ペプチド フラグメント ライゲーションおよび大環状化との組み合わせによって可能になりました。

主な成果

ATP-graspリガーゼを用いた3酵素カスケードアセンブリ

- 3 つの酵素カスケード (2 つの人工 ATP 把握リガーゼ + ATP リサイクル) により、保護されていないアミノ酸からテトラペプチドが組み立てられます。 ATP 把握リガーゼ (特に ATP 依存性アミノ酸リガーゼ、AAL) は、エネルギー源として ATP を使用して、保護されていないアミノ酸またはペプチド間のアミド結合形成を触媒する酵素です。その機構は混合無水物中間体を介して進行し、求核性アミンまたは活性化アシル供与体上の保護基を必要とせずに直接カップリングを可能にします。この研究では、研究者らはビフィドバクテリウム・アドレセンティス（BaAAL）由来のATP-graspリガーゼと操作された変異体（Trp-BaAALEngおよびPhe-BaAALEng）を使用して、ワンポットカスケードで2つの非天然アミノ酸（トリプトファンおよびフェニルアラニン類似体）を含むジペプチドを選択的に伸長しました。これらのリガーゼは、求電子剤 (C 末端基質) として単一のアミノ酸を受け入れますが、N 求核剤としてより長いペプチドを受け入れることができる、狭く埋め込まれた求電子剤ポケットを持っています。この選択性により、C 末端から N 末端まで保護基を使用せずにペプチドを連続的に構築するのに理想的となります。消費された ATP は、リン酸供与体として安価なヘキサメタリン酸を使用するポリリン酸キナーゼ (FbPPKWT) を使用してリサイクルされます。

改変エステラーゼ (RsEstEng) の位置選択的マクロラクタム化

- 改変エステラーゼ (RsEstEng) は位置選択的マクロラクタム化を触媒し、ノーザン フラグメントを形成します (収率 73%、52 kg スケール)。 RsEstEng は、Roseibacillus sp. から同定された野生型カルボキシルエステラーゼ (RsEst) に由来します。その本来の機能はエステル結合の加水分解です。研究者らは、指向性進化を通じて、エンシチドのノーザンフラグメント(4)の合成において、それを位置選択的マクロラクタム化（大環状アミド結合の形成）の触媒に変換した。 直鎖状テトラペプチド(9)の安定で嵩高いtert-ブチルエステルをアシル供与体として受け入れて大環状ペプチド(4)を生成し、分子内アミド結合を形成します。以前の酵素カスケードによる高イオン強度条件下でも、オリゴマーは検出できず、エステル加水分解副生成物はわずか 0.8% で選択的環化が達成されました。

改変チオエステラーゼ (BlTEEng) 分子間ライゲーション

- 改変チオエステラーゼ (BlTEEng) は、エピマー化を行わずにノーザン フラグメント (4) とイースタン フラグメント (3) の分子間ライゲーションを実行します。 BlTEEng は、ブレビバチルス ラテロスポラス (BlTE) の非リボソーム ペプチド シンテターゼ (NRPS) から元々切除されたチオエステラーゼ (TE) ドメインの修飾バージョンです。 NRPS システムにおける野生型チオエステラーゼは、通常、大環状化、またはチオエステル結合を介したキャリアタンパク質からの直鎖状ペプチドの放出を触媒します。 B1TE の操作された変異体はある程度の活性を示しましたが、二量体の副産物を優先しました。酵素工学により、天然の加水分解に不安定なチオエステルの代わりに、より安定なイソプロピルオキソエステルを使用して分子間ライゲーションを触媒するように酵素が変更されました。

4 酵素カスケード還元的アミノ化大環状化

- 4 つの酵素カスケード (PsIREDEng、KsKREDEng、および補因子リサイクリング酵素 StLDHWT、TvADHWT) は、還元的アミノ化大環化を達成して二環式ジアミンを形成します (収率 69%、46 kg スケール)。 KsKREDEng は、Kyrpidia sp. 由来の遺伝子操作されたケトレダクターゼです。 NAD+ に依存して、ベンジルアルコール化合物 (10) の一時的なアルデヒド (11) への酸化を触媒します。 PsIRED は、Pseudogymnoascus sp. 由来のイミン レダクターゼです。 NADPH依存性です。 PsIREDEng は、アルデヒド (11) と既存のアミンの還元的アミノ化を触媒して環状イミン (12) を形成し、続いて第二級アミン大環状分子 (13) に還元します。 StLDHWT はピルビン酸を乳酸に還元することにより酸化ステップで NAD+ を再生しますが、TvADHWT はイソプロパノールを酸化してアセトンに還元することにより還元ステップで NADPH を再生します。

改変された PBP チオエステラーゼによる最終的な大環状化

- ウェスタンフラグメント (2) と化学結合し、続いて人工ペニシリン結合タンパク質チオエステラーゼ (SsPBP-TEEng) を行うと、高濃度 (70 g/L) で最終的な大環状分子が閉じられ、典型的な希釈限界 (従来の合成では 5 g/L) が克服されます。 全体的なプロセスには、3 つのカスケード ステップ、7 つの人工酵素 + 3 つの補助酵素、全体の収率 39%、数キログラム規模の実証、純度 >99%、クロマトグラフィーなし、保護基なしが含まれます。この研究は、複雑な大環状ペプチドを製造するための持続可能でスケーラブルな青写真を提供し、工程数と無駄を大幅に削減しながら、効率と患者アクセスを向上させます。